使用高效液相色谱仪检测
2.6 指纹图谱建立及分析
2.6.1 指纹图谱的建立鹃素建立
取“2.1”项的对照品溶液和“2.2”项下供试品溶液，按“2.3.1”项的满山色谱条件，使用高效液相色谱仪检测。红叶含量所得满山红叶HPLC对照图谱见图4，指纹15批满山红叶色谱叠加图见图5。图谱
图4所示，并测该指纹图谱找到10个共有峰，定杜通过与对照品色谱图对比，建立鹃素确认10号峰为杜鹃素，满山并将9号峰作为参照S峰。红叶含量
2.6.2 相似度分析
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2012版)，指纹采用中位数法依次进行15批满山红叶指纹图谱的图谱相似度评价，结果见表9。并测根据表9能够得出，定杜15批满山红叶纹图谱整体相似度在0.986～0.999，建立鹃素均>0.9，具有较高的一致性。
2.6.3聚类分析
将15批满山红叶的10个共有峰峰面积导入SPSS 20.0，运用平均欧式距离法，进行聚类分析，见图6。分类结果表明不同产地满山红药材在分类距离上较远，即使同一产地其分类距离也存在明显差异性。初步分析，可能与满山红药材采摘时间、贮存方式、气候等有关。15批满山红叶在产地和批次上其主化学成分种类具有代表性，指纹图谱能够反映出样品的全貌。
3 讨论
本实验供试品的制作方法，考察了不同提取溶剂和提取方式对满山红叶指纹图谱的影响。在提取溶剂方面，选取了水、60%甲醇、稀乙醇三种溶剂作为提取溶剂，结果发现，满山红冻干粉在三种溶剂中的溶解度都很好，但是以水作提取溶剂的色谱图无论在出峰数目还是分离度上均优于其他两种溶剂的色谱图，因此选择水作为提取溶剂。在提取方式方面，选择了超声提取法和回流提取法，结果发现，2种方法提取的满山红叶色谱图差别很小，但是超声提取方法更加简便，因此选择超声的方法作为提取方法。
本实验对于色谱条件的确定，考察了色谱柱、检测波长、流动相系统，流速、柱温对满山红叶指纹图谱的影响。在色谱柱方面，选了Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm）和YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm）色谱柱，结果表明样品在Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm）和YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm）中不能达到分离要求，而在Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）色谱柱中不仅出峰快、数目多而且分离度符合要求，所以选择Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）色谱柱作为该实验色谱柱。
在检测波长方面，用二极管阵列检测器检（DAD）中200～400 nm依次扫描对照品溶液和供试品溶液，结果显示在检测波长297 nm处2个样品均有最大吸收，色谱图信息丰富，杜鹃素峰高较高，所以选用297 nm为检测波长。在流动相系统方面，选取不同种类有机相（甲醇、乙腈）和不同成分水相（0.3%甲酸水溶液、0.3%醋酸水溶液）构成的流动相系统对供试品溶液色谱峰分离的影响，筛选乙腈-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%醋酸水溶液等流动相系统，结果显示，乙腈-0.3%甲酸水溶液流动相系统不利于样品的分离，出峰数目稀少且分离度不好，甲醇-0.3%甲酸水溶液和甲醇-0.3%醋酸水溶液流动相系统对样品分离差别不明显，但是甲醇-0.3%甲酸水溶液流动相系统色谱图信息更丰富，分离度更好，故确定该流动相系统作为该实验检测的流动相。在流速方面，选择了0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.25 mL·min-1进行筛选。结果表明，用0.1 mL·min-1流速检测色谱峰出峰不完全，用0.25 mL·min-1流速检测色谱峰分离度不好，用0.2 mL·min-1流速检测色谱峰出峰数目完全，分离度较好，故确定流速为0.2 mL·min-1。在柱温方面，对25℃、30℃、35℃柱温进行筛选。结果表明升高柱温，分离效果变差，因此确定了25℃作为检测柱温。
15批满山红叶的指纹图谱整体相似度范围0.986～ 0.999，均>0.9，相似度良好，15批满山红叶中杜鹃素含量RSD为0.11%，表明其含量没有明显差异，但是聚类分析结果将15批满山红叶分为四类，且10个共有峰峰面积的RSD范围6%～30%，说明杜鹃素的含量对其整体含量变化影响很小，其他化学成分含量变化起主要作用，初步分析应该与满山红中草药产地、生长环境、采摘时间、放置条件和放置时间等有关。
本研究运用高相液相色谱分析法，建立了满山红叶的指纹图谱，该指纹图谱可以全面展现满山红叶化学成分的特点，适用于因产地、批次、生长环境等因素的不同，出现的质量不均一的满山红叶。该方法简便易行，指纹峰分离度好，具有较高的可信度，为后续满山红叶的研究开发提供科学依据。
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